大丽轮枝菌引起的黄萎病是目前危害棉花生产最主要的病害，严重影响棉花的产量和品质。探究棉花免疫反应激活的分子机制，挖掘关键抗病基因并解析其功能机理，创制抗病新种质，是提高棉花抗病性最直接和有效的策略。植物通过细胞表面受体感知外界刺激并启动免疫应答反应，这些表面受体包括受体类激酶和受体类蛋白，它们识别病原相关分子模式，并将防御信号传递至下游分子网络。细胞壁相关受体类蛋白激酶（WAKLs）具有胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，胞外钙结合的EGF类结构域或半乳糖醛酸结合（GUB_WAK_bind）结构域，在胁迫信号感知及抗病反应激活过程中发挥着重要作用。然而目前在棉花抵御黄萎病菌的过程中，关键的WAKLs基因及其调控下游免疫应答的分子机制仍不明确。
近日，棉花遗传与种质创新利用团队在国际知名学术期刊Advanced Science在线发表了题为“GbWAKL20 Phosphorylates GbNFYB8 to Modulate Verticillium Wilt Resistance in Cotton”研究论文。该研究揭示了棉花GbWAKL20-GbNFYB8模块激活下游MAPK级联及SA信号通路，进而提高棉花黄萎病抗性的分子机制。
研究前期结合基因组分析、黄萎病菌诱导表达转录组分析及基因沉默抗病性鉴定实验，明确了一个重要的WAKs/WAKLs家族成员GbWAKL20。该基因在棉花的根和茎中优势表达，且受到黄萎病菌诱导后显著上调表达。在棉花中沉默GbWAKL20会抑制MAPK级联和SA信号通路介导的免疫响应，导致植株抗病性显著降低；在拟南芥中异源过量表达该基因促进免疫相关进程，MAPK级联和SA信号通路在黄萎病菌诱导后显著激活，阻止病原菌侵染及定殖。GbWAKL20利用胞外GUB_WAK_bind结构域识别外界的胁迫信号，并通过胞内保守的Ser/Thr激酶结构域向细胞内传递信号。通过亚细胞定位分析，明确了GbWAKL20以高尔基体囊泡的形式沿质膜-内质网-核膜运动并进行复杂的信号交流。结合黄萎病菌诱导后的酵母文库筛选、荧光素酶互补、双分子荧光互补、Co-IP及Pull-down等实验证明GbWAKL20与转录因子GbNFYB8互作，并进一步明确了它们相互作用的区段、位置以及特异性。体内和体外实验均证明GbWAKL20通过胞内激酶结构域结合并磷酸化GbNFYB8，位于CBFD_NFYB_HMF结构域的Ser-76残基是关键的磷酸化位点。GbNFYB8主要定位在细胞膜、内质网及细胞核的周围，当被GbWAKL20磷酸化后会大量转移到细胞核内部，发挥其转录调控功能。与沉默GbWAKL20一致，在棉花中沉默GbNFYB8明显抑制MAPK级联和SA信号通路，削弱植株的黄萎病抗性。基于转录组联合分析、酵母单杂交、LUC/REN双荧光素酶和凝胶迁移实验，证明了GbNFYB8能结合下游MAPK3及WRKYs基因启动子区的CCAAT元件，促进基因表达；而GbWAKL20介导的磷酸化能明显增强GbNFYB8的转录激活能力。整合多种防御信号，通过调节抗病蛋白表达、细胞壁修饰及代谢重编程等，显著提高植株的抗病性。
综上，该研究揭示了GbWAKL20提高棉花黄萎病抗性的分子机制。GbWAKL20通过胞外结构域感知外界胁迫信号，通过胞内激酶结构域磷酸化GbNFYB8，促进GbNFYB8转移到细胞核并激活下游防御反应。本研究丰富了棉花抗黄萎病的分子机制网络，加深了对棉花免疫相关通路激活的理解，为培育抗黄萎病棉花品种提供了理论基础和基因资源。
GbWAKL20-GbNFYB8协同调控棉花黄萎病抗性工作模式图
