棉花是世界性重要的经济作物。由大丽轮枝菌引起的黄萎病是威胁棉花生产最严重的病害。由于黄萎病菌定殖于植株木质部维管组织，使用化学杀菌剂很难有效控制病情，且污染环境。挖掘关键抗病基因资源，解析其作用机制，进而培育抗黄萎病棉花新品种是最合理有效的防治策略。

陆地棉和海岛棉是两大主要的棉花栽培棉种，大部分海岛棉对黄萎病具有明显的抗性，而占全球90%以上种植面积的陆地棉品种普遍缺乏抗病性。鉴定海岛棉基因组中的抗性位点及相关基因，应用于陆地棉黄萎病抗病性遗传改良对于棉花抗病育种具有重要意义。棉花黄萎病抗性是一种复杂的遗传性状，由多基因控制且易受环境影响。目前结合分子标记辅助选择、全基因组关联分析及多组分析等方法已在海岛棉中挖掘到一些潜在的抗病基因或位点，但功能验证及系统的分子机理解析尚需进一步深入。随着黄萎病危害的不断升级，急需发掘更多抗病基因，并进一步明确其功能，实现棉花高产稳产与抗病的精准调控与育种利用。

近日，棉花遗传与种质创新利用团队在国际著名学术期刊Advanced Science在线发表了题为“Natural SNP Variation in GbOSM1 Promotor Enhances Verticillium Wilt Resistance in Cotton”的研究论文。该研究证明了海岛棉中渗透素蛋白GbOSM1在抑制黄萎病菌生长以及触发植株免疫应答反应过程中的重要作用，揭示了GbOSM1启动子中A/G自然变异影响NFYA5转录因子的结合，进而导致不同棉花材料中OSM1表达水平及植株抗病能力不同的分子机制。

众所周知，黄萎病菌与植物军备竞赛进程中，植物已经进化出了PTI和ETI两套免疫系统，它们最终都通过激活相类似的下游反应，包括活性氧积累、激素信号转导及防御相关蛋白的表达等应对病原菌攻击。病程相关蛋白是一类重要的防御蛋白，也是植物抗病反应的关键生化指标。病程相关蛋白在病原菌侵染后分泌到细胞外空间，最大限度的阻止病原菌进一步繁殖。目前，棉花在抵御黄萎病菌过程中的关键病程相关蛋白基因及其作用机制在很大程度上仍需进一步发掘与探究。

本研究基于前期构建的以抗病品种海岛棉Hai7124和感病品种陆地棉Junmian1为亲本的BC1分离群体，结合基因型和单株发病率表型开展抗病主效位点精细定位，在D11染色体鉴定到一个与黄萎病抗性显著相关的QTL区间。结合受黄萎病菌诱导的棉花根组织转录组分析，发现其中一个渗透素蛋白基因GbOSM1与黄萎病抗性显著相关。GbOSM1属于病程相关蛋白5基因家族，与前人报道的棉花GhPR5/GhOSM34同源性为60.49%。GbOSM1在抗病材料海岛棉Hai7124根中的表达和黄萎病菌诱导表达水平均很高，而在感病材料陆地棉TM-1的根中几乎不表达。在Hai7124中特异性沉默GbOSM1后，植株对黄萎病的抗性明显降低；在陆地棉中过量表达GbOSM1，植株的抗病性显著提高。研究发现GbOSM1的转录水平与植株的抗病性呈明显的正相关。将体外原核表达并纯化的His-GbOSM1蛋白加到带有黄萎病菌的培养基中，能明显抑制菌丝发育和分生孢子产生，蛋白浓度越高对病原菌的抑制效果越强。体外酶活分析显示His-GbOSM1可以水解真菌细胞壁多糖中的β-1,3/1,4/1,6-键。表明GbOSM1可直接破坏细胞壁组分，抑制病原菌生长。亚细胞定位分析表明GbOSM1-GFP绿色荧光信号定位于液泡。在渗透胁迫或黄萎病菌感染后，GbOSM1-GFP蛋白可以分泌并积累于质外体发挥防御功能。

研究发现过量表达GbOSM1的转基因棉花能激活植株全面的免疫反应。转录组及RT-qPCR分析表明受体类激酶及受体类蛋白（RLKs和RLPs）、钙离子调控及结合相关基因、激素合成和信号转导相关基因、ROS代谢相关基因、病程相关蛋白基因（PRs）和抗病蛋白基因（R genes）等在转基因植株中均明显上调表达。

通过比较Hai7124和TM-1的OSM1基因组序列以及上游启动子序列，发现在ATG上游186 bp位置存在一个A/G碱基差异，该SNP变异导致被NFYA转录因子结合的CCAAT基序突变为CCGAT。自然群体分析表明，335份陆地棉材料均为CCAAT基因型，而269份海岛棉材料中，61.59%为CCGAT基因型，39.41%为CCAAT基因型。研究发现，与CCAAT基因型的海岛棉材料相比，CCGAT基因型的海岛棉材料具有更高的OSM1转录水平及黄萎病抗性。NFYA5是一个显著受黄萎病菌诱导的转录因子，其负调控OSM1表达。通过酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移（EMSA）、LUC酶活检测及GUS组织染色实验等进一步明确了Hai7124中GbNFYA5不能与CCGAT基序结合，而TM-1中GhNFYA5能与CCAAT基序结合并抑制下游GhOSM1的表达。研究进一步发现，通过VIGS方法沉默陆地棉TM-1中的GhNFYA5，导致GhOSM1的表达水平提高，植株抗病能力增强；而在海岛棉Hai7124中沉默GbNFYA5对抗病性基本无影响。说明CCAAT/CCGAT基序的差异影响了NFYA5对下游OSM1表达的调控作用。

综上，该研究揭示了OSM1启动子中A/G自然变异影响其转录水平差异以及植株抗病性的分子机制。GbOSM1是新鉴定的棉花渗透素蛋白，属于病程相关蛋白5基因家族。GbOSM1能水解黄萎病菌的细胞壁并激活植物免疫反应，进而提高植株抗病性。在自然群体中，OSM1同源基因的启动子区存在A/G碱基差异，导致产生CCAAT/CCGAT两种单倍型。陆地棉自然群体材料均为CCAAT类型，而海岛棉自然群体存在CCAAT/CCGAT两种类型。NFYA5结合CCAAT元件，负调控OSM1表达。在陆地棉材料中，GhNFYA5与CCAAT元件结合，抑制下游GhOSM1的表达及植株抗病性。而在CCGAT基因型的海岛棉材料中，GbNFYA5不能与CCGAT元件结合，解除了对GbOSM1的抑制表达，导致GbOSM1转录水平高，植株抗病能力提高。本研究加深了对棉花渗透素蛋白抵御病原菌分子机制的深入认识，也为培育抗黄萎病棉花新品种提供了理论基础和基因资源。

图. 棉花OSM1启动子中A/G自然变异影响植株抗病性的工作模式图

钟山青年研究员王桂林博士为论文第一作者，实验室郭旺珍教授和生命科学学院王心宇教授为论文共同通讯作者。团队王海棠博士和已毕业研究生郑启航在转基因材料创制方面做了大量工作。钟山青年研究员李维希博士参与了转录组数据分析。张大勇副教授，在读研究生孔荩敏、陈智国、郭展、柳汉桥和已毕业研究生阮潮峰、邓超阳等参与了部分研究工作。该研究得到国家自然科学基金项目、江苏省自然科学基金项目、江苏省卓越博士后计划、中国博士后科学基金项目、江苏现代作物生产协同创新中心等项目资助。